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β-甘露聚糖酶在植物乳桿菌中的組成型表達與表面展示

2019-11-01 09:08

文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

甘露聚糖酶能隨機催化水解含有β－1，4甘露糖苷鍵的β－1，4甘露聚糖、葡甘露聚糖及半乳甘露聚糖生成甘露寡糖。已有研究證明，甘露寡糖對人和家畜的健康具有促進作用。

研究表明，甘露聚糖酶能夠利用誘導型表達載體pSIP在植物乳桿菌中有效的生產(chǎn)和表達。但是在進行游離酶的分離純化時酶容易被破壞。此外，蛋白質(zhì)的化學固定化也是一個費力并且有害的過程，存在一些缺點，如酶活性的回收率低，在反應(yīng)過程中酶活逐漸喪失、一些固定化酶與底物之間傳質(zhì)阻力大……等等。因此，在所謂的基因固定化中，利用細菌作為固定化基質(zhì)，合成與錨定基序融合的蛋白質(zhì)，然后將其錨定在細菌細胞表面，很容易從培養(yǎng)中獲得固定化酶。這種方法通過讓細胞完成整個過程，實際上克服了游離酶或傳統(tǒng)固定的許多限制。此外，表面展示酶在惡劣條件下具有很高的耐受性或穩(wěn)定性，特別是當?shù)鞍踪|(zhì)嵌入細菌細胞壁時，可以在多個工藝循環(huán)中重復使用。

深入了解不同錨定基序的作用機制，將對乳酸菌細胞表面系統(tǒng)的研究和開發(fā)具有食品和生物技術(shù)應(yīng)用價值的酶的固定化具有重要意義。原則上，一種外源蛋白主要可以通過兩種策略附著到乳酸菌細胞的包膜上，一是采用錨定脂蛋白或利用sortase酶途徑與細胞膜或細胞壁以共價鍵附著在一起。另外則可以采用一個蛋白質(zhì)域以非共價的方式與細胞壁或膜的成分形成強烈相互作用。

針對與食品相關(guān)的應(yīng)用，使用可誘導的乳酸菌表達載體（需要在培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加合成誘導劑）可能不是首選。此外，誘導表達系統(tǒng)不適合在與人體內(nèi)進行治療，也不適合應(yīng)用于酶制劑的原位生產(chǎn)中。因此，使用組成型表達載體生產(chǎn)蛋白質(zhì)將是一種不錯的選擇。

越南峴港大學生物技術(shù)系的Nguyen等人2019年在《Microbial Cell Factories》雜志上（IF 2018＝4．402，生物工程與應(yīng)用微生物2區(qū)）發(fā)表了題為“Constitutive expression and cell－surface display of a bacterial β－mannanase in Lactobacillus plantarum”的文章。在該研究中，作者研究了兩個組成型啟動子：來自嗜酸乳桿菌NCFM的Pgm啟動子和嗜酸乳桿菌ATCC4356的SlpA啟動子，隨后利用這兩個啟動子在植物乳桿菌WCFS1中表達含有脂錨定蛋白Lp＿1261的β－甘露聚糖酶。這些組成型啟動子被證明是乳酸桿菌胞內(nèi)產(chǎn)生外源蛋白的強啟動子，但是利用這些啟動子在細胞外表達和在細菌細胞表面顯示外源蛋白的研究尚未見報道。因此，對這些活性甘露聚糖酶表面展示的組成型啟動子的功能進行評估，可能為開發(fā)安全的、食品級的全細胞生物催化劑鋪平道路，這些催化劑可用于生產(chǎn)促進健康的低聚糖。

所用到的主要方法

METHODS

（1）質(zhì)粒構(gòu)建

（2）凝膠電泳和Westernblotting

（3）流式細胞術(shù)和間接免疫熒光顯微鏡分析

（4）薄層色譜

（5）高效陰離子交換色譜（HPAEC）

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

由于乳酸菌的食品級地位和益生菌的特性，一些乳酸菌被認為是安全有效的細胞工廠。本研究旨在對地衣芽孢桿菌DSM13的一種甘露聚糖酶進行組成型表達，該酶隨后被展示在植物乳桿菌的細胞表面，用于寡糖生產(chǎn)的全細胞生物催化劑。來自嗜酸乳桿菌NCFM和嗜酸乳桿菌ATCC4356的兩個強組成性啟動子，Pgm和SlpA，分別取代乳酸桿菌pSIP表達系統(tǒng)中的誘導啟動子進行載體構(gòu)建。作者將甘露聚糖酶編碼基因（manB）與植物乳桿菌N端脂錨定蛋白（Lp＿1261）融合并克隆到組成型pSIP載體中，在植物乳桿菌WCFS1中進行了表達。然后，通過流式細胞術(shù)和免疫熒光顯微術(shù)實現(xiàn)了對該蛋白在細菌細胞表面的定位，并對構(gòu)建的植物乳桿菌細胞表面甘露聚糖酶活性和重復利用度進行了評價。結(jié)果顯示：在Pgm和SlpA啟動子的控制下，植物乳桿菌細胞表面獲得的甘露聚糖酶活性最高，分別為1200 U／g和3500 U／g干細胞重量，分別比誘導的pSIP錨定載體所獲得的活性高2．6倍和7．8倍。表面展示的甘露聚糖酶能夠?qū)肴楦事毒厶墙到獬筛事豆烟�。本研究使用的方法，利用強大的組成型啟動子，使一種β－甘露聚糖酶在植物乳桿菌細胞表面實現(xiàn)了組成型表達和表面展示，這將有助于實現(xiàn)重組蛋白在無需添加誘導劑或改變宿主菌株生長條件下進行持續(xù)地合成。